随着重组DNA技术的迅猛发展，外源基因在不同宿主中的表达使得各种重组蛋白的工业生物生产成为可能。选择合适的宿主是生物工艺设计中的关键步骤之一，具体取决于：1.上游培养效率2.易于基因编辑和分子工具的可用性3.翻译后修饰的能力，如糖基化4.蛋白质（用于下游加工和作为生物制药成分等）的分泌能力目前，多种生物已被应用于重组蛋白的生产，尤其是大肠杆菌，易于基因改造，具有在酵母水解物等多种基质上快速生长并产生高蛋白滴度的优势。已成为迄今为止业界追捧的主力军。典型的生物工艺优化通常需要进行一些初步试验，以发现适用于宿主菌株并提高目的重组蛋白表达的培养基成分（特别是氮基营养素）。对于此类应用需求，能够提高实验效率和参数准确度的高通量筛选平台成为热门工具。贝克曼库尔特BioLector通过在线测量关键培养参数提供可放大的高通量分析。本案例为通过BioLector对多种酵母营养素就生物量生长和重组蛋白的形成进行评估和比较，筛选出了适合大肠杆菌重组蛋白生产和诱导时间的理想培养基。方法培养菌株：大肠杆菌BL21(DE3)pET-28a(+)EcFbFP。培养基：以标准TB培养基（Carl Roth）为参照物，对多个TB 样（Terrific 液）培养基进行比较。不同的TB 样培养基使用不同的酵母提取物。BioLector培养条件：在接种至微孔板之前，先在250 mL摇瓶中进行预培养， 37°C培养6小时。然后使用48孔梅花板（MTP-BOH2）在 BioLector中进行培养。温度 37°C ，振摇速度：1400 rpm。分别在每个培养孔中填充800μL培养液用于非诱导实验，填充790μL用于诱导实验。诱导实验中，在诱导时间点上添加 10μL 50μM 的 IPTG。环境氧气浓度保持在35%，避免培养物缺氧。BioLector在线测量：培养过程中对生物量、EcFbFP(黄素荧光蛋白)、pH以及 DO进行在线测量。结果不同TB样培养基的生物量生长情况：培养实验中，不同酵母营养素的培养基中生物量的生长情况如上图所示：培养基不同，最终的光密度和生长速率也会不同。ProCel 6 中的大肠杆菌OD最高，培养基 ProCel 3 中的大肠杆菌的OD低。ProCel 6为本特定工艺的最高生长速率。上图为培养过程的DO值。培养基 ProCel 3 和 ProCel 4 中的培养物未达到0%的氧饱和度，这表明由于耗氧量有限，该培养基中的菌株代谢活性较低。相反，其他培养物包括TB标准培养基，均在短时间内达到0%的氧饱和度，表明菌株代谢活性高。不同酵母营养素TB样培养基的产物生成：通过将IPTG 添加到培养物中来诱导 T7 聚合酶的表达促进黄素荧光蛋白的生成。BioLector使用梅花板为48个培养物提供了独立的培养空间，因此可测试不同的诱导时间点。使用自动化工作站整合BioLector后的 RoboLector 系统还可以自动进行培养诱导。首先选择一个固定的诱导时间点。分别为培养启动后的3小时、3.75小时和4.5小时。下图所示为每种TB样培养基在诱导时间下所测荧光的平均值。荧光动力学清晰地表明不同培养基有不同的EcFbFP（黄素荧光蛋白）表达水平。表现出最强荧光信号的两个样本为：ProCel 2，诱导点为3.75小时；ProCel 5，诱导点为 3 小时。经过 7.7 小时的培养，ProCel 5 的荧光值达到102.94a.u.，而ProCel 2 的荧光值达到 101.82 a.u.。本方法的不足之处在于未比较不同样本的生物量对蛋白质产量的影响。经过3小时的培养，一些培养物的OD已达到6，而其他培养物仅达到3。当诱导具有不同光密度的培养物时，可能会对在每种酵母营养素上生长的实验大肠杆菌的蛋白质生产性能造成误解。鉴于此，我们采用了一种新方法，将诱导点与生物量信号耦合。使用BioLector的信号驱动RoboLector，依赖于特定生物量的诱导对于每个单独的孔都是可行的。为自动化工作站设置3、6或8的OD目标值，以根据孔内培养物的生长动力学自动添加IPTG以诱导蛋白质生产。如下图所示，ProCel 2表现最佳，最终值为 146.23 a.u.，培养时间是 12.3 小时；ProCel 5表现次之，最终值为138.1 a.u.。与之前进行的一系列实验相比，本实验中的排名与在特定时间点进行诱导的实验不同。这一观察证明了最佳工艺条件的重要性，并使这些条件具有可比性。此处数据表明：与之前的实验相比，本实验中的荧光值更高。正如该领域诸多论文中所强调的那样，诱导时间确实是一个关键参数。同样，在优化大肠杆菌重组蛋白生产的过程中，也必须评估诱导剂的浓度。另外，与对照TB培养基相比，这里测试的一些酵母氮源产生了更高的重组蛋白产量。这些结果凸显了选择培养基成分的重要性，这些成分能够在特定的生物工艺中实现高而稳定的产量。结论通过BioLector系统，贝克曼库尔特可为用户提供适用于各种应用领域的高通量筛选平台。其独特的梅花形微孔板尤其适用于好氧培养，如同实验室生物反应器，BioLector系统通过非侵入式传感器使客户能够获取更多的在线测量参数。正如本应用，通过BioLector系统可轻松实现培养基的筛选，整合自动化工作站的RoboLector，还可实现更多功能。补料、pH调控以及文中所述的诱导功能，所有这些均可在小规模实验中实现，帮助客户同时兼顾成本和效率。RoboLector高通量自动化微型生物培养平台欲了解该应用详情，请扫描下方二维码下载应用指南《利用BioLector进行大肠杆菌重组蛋白生产用酵母营养素的筛选》

这一里程碑为FibroScan ® 最终取代MASH药物开发中患者入组和治疗反应评估的肝脏活检开辟了道路无创肝脏诊断领域的领导者 Echosens 宣布，美国食品药品管理局（ FDA ）药物评估和研究中心（ CDER ）新药办公室已接受该公司关于通过振动控制瞬态弹性成像（ FibroScan ® ）进行肝硬度测量的意向书，作为代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎（ MASH ）临床试验中合理可能的替代终点。这是FDA首次接受非侵入性测试作为MASH药物开发的合理可能替代终点， MASH是一种可导致肝硬化、肝癌、移植或死亡的进行性、晚期脂肪性肝病。 在FDA发布的一份通信中， CDER肝病学和营养部主任Frank Anania医学博士表示： “该提案代表了在MASH药物开发中采用非侵入性测试的重要一步。”如意向书所述， VCTE （ FibroScan ® ）的LSM可以预测MASH患者的全因死亡率或肝脏相关事件的风险。 接受意向书为FibroScan ® 开辟了一条道路，最终取代肝活检作为为加速批准成人非肝硬化MASH药物而设计的试验的中期分析的主要终点。用FibroScan ® 取代目前用于招募患者和监测治疗反应的重复肝脏活检，将减轻患者的重大负担。 FibroScan ® 检查只需几分钟，无痛，并全面评估肝脏，提供肝脏健康的全貌，可以根据需要经常重复。弗吉尼亚联邦大学内科医学院Stravitz-Sanyal肝病与代谢健康研究所教授兼主任、医学博士Arun Sanyal说： “接受这份意向书是一个重要的里程碑，建立在多年的临床研究和出版物的基础上，以及该领域众多利益相关者不懈努力的基础上，对该领域具有重大影响，预计将加速药物开发，并易于转化为临床实践。”FibroScan无与伦比的临床验证及其在肝脏药物开发的关键药物试验中的使用，特别是针对MASH ，推动了FDA对意向书的前所未有的接受。 作为全球公认的领先的肝脏健康非侵入性解决方案， FibroScan ® 得到了5,600多份同行评审出版物的支持，其中包括关键出版物（ Gawrieh等人， 肝病学杂志 ， 2024 ， Lin等人， JAMA ， 2024 和 Mózes等人。， Lancet Gastroenterol Hepatol, 2023 ） ，表明VCTE引起的LSM变化与肝脏相关结局相关。 此外， FibroScan ® 已经是所有进行MASH试验的关键制药公司和生物技术公司的参考点非侵入性测试。 Echosens向FDA提交的文件包括礼来、勃林格殷格翰和诺和诺德的正式支持信。对于制药公司而言，接受FibroScan ® 作为合理可能的替代终点，将有可能通过改善试验招募和患者保留来改变MASH的药物开发。 这一里程碑可以加速新疗法的发展，同时帮助研究人员设计更安全、更具代表性、更高效的试验。 纽卡斯尔大学医学院副校长Quentin Anstee教授表示： “FDA接受此意向书是最终采用非侵入性测试作为MASH临床试验中合理可能的替代终点的关键第一步。 这向所有制药赞助商发出了一个明确的信号，即在其正在进行或未来的MASH临床试验中收集强大的非侵入性生物标志物数据。”除了所有重要指南中对FibroScan ® 的现有建议及其在付款人政策中的首选位置之外， FDA接受此意向书进一步加强了FibroScan ® 作为参考无创测试的地位，以处方和监测MASH治疗-包括已经批准和未来的治疗。 这一里程碑也凸显了Echosens的领导地位和持续创新，该公司最近在最新一代FibroScan ® 设备中采用引导式VCTE技术，提高了效率、自动化和标准化，使所有医疗保健提供者的肝脏扫描无缝衔接。 关于Echosens作为该领域的先驱，Echosens公司凭借FibroScan®无创肝脏健康综合管理解决方案，显著改变了肝脏评估的实践方式。 FibroScan ® 已在全球范围内得到认可，并通过了超过5,600篇同行评审出版物的验证，其中包括近220篇国际指南。 Echosens已在超过127个国家/地区提供FibroScan®，为全球数百万人提供了肝脏检查。 消息来源 : Echosens